多肽化学仿制药质量研究的特殊技术要求尚不完善

肽类药物是一类氨基酸通过肽键连接的化合物（见图1）。 目前尚无法准确定义。 一般而言，具有明显生物活性的肽均可视为肽类药物。 多肽药物可通过天然物质提取、化学合成、天然微生物发酵、生物重组表达等方法制备。 从药品注册角度来看，各国监管部门根据肽的制备方法对此类药品进行分类。 例如，化学合成肽按化学药品管理，重组表达肽按生物制品管理。 此外，美国FDA将由不超过40个氨基酸组成的多肽和41～99个全合成肽进一步细分为肽化学药物，41～99个非化学合成肽或由100个以上氨基酸组成的肽为肽生物药。产品[1]，尚未看到其他监管机构的相关说法。 目前，全球批准上市的多肽药物已超过100种，其中多款药物已在我国上市[2]，涉及生殖、消化、血液、妇科、外科、神经、肿瘤等多种适应症领域。内分泌领域，利拉鲁肽、格拉替雷、戈舍瑞林等众多重磅产品，说明国内外药企对多肽药物研发和应用的热情。 但与普通小分子药物相比，多肽药物具有分子结构复杂、活性高、特异性强的特点。 同时，它们的稳定性比较差，可能存在免疫原性等特殊的安全问题。 在这种情况下，对该类药物的研发和监管提出了更高的挑战。 本文参考现有技术法规，特别是国际监管同行的研究和审评经验，并结合相关文献案例，介绍一些肽化学仿制药质量研究过程中需要注意的一些特殊技术要求，希望能为我的研究提供指导。国家的肽化学仿制药。 药品研发和监管提供了一些有意义的教训。

1多肽化学仿制药监管现状

与普通小分子化学药物相比，各国监管机构和国际组织对多肽化学药物的技术要求尚不完善，监管文件相对缺乏，存在一定的监管空白。 表1列出了目前涉及肽类化学药物的各国和国际监管机构仅有的官方技术支持文件。

其中，国家食品药品监督管理局（以下简称国家总局）早在2007年就发布了《合成肽药物药物研究技术指导原则》，表明我国早已开始重视该研究以及此类药物的开发和监督。 同时，在《化学》《药物原料制备及结构确证研究技术指导原则》中也提到了肽类药物的一些关键技术要求。 上述指导原则出台10多年来，对我国多肽化学药物的发展起到了一定的推动作用。 但由于种种原因，它们没有及时更新，不能完全满足当前多肽药物研究和审评的需要。 在我国仿制药一致性评价的背景下，考虑到多肽药物的复杂性，上述指导原则在仿制药与参比制剂一致性评价方面还有进一步完善的空间。 近日，国家药品监督管理局药品审评中心于2023年2月发布《化学合成肽药物药学研究技术指导原则（试行）》，为进一步指导化学合成肽药物药学研究，提供参考技术标准。 [3]，为今后我国多肽仿制药的研发和监管提供了依据。 国外监管机构中，ICH Q系列指南中的Q3A和Q3B显然不适用于肽类药物； Q6A被证明适用于小于10个氨基酸的低分子量合成肽，但不适用于高分子肽和多肽，且尚未具体阐述肽化学药品的特殊要求； Q6B 显然不适用于合成肽。 欧盟尚未发布针对肽化学药物的具体指南。 仅在《抗生素药品杂质限量指南》和《欧洲药典药用物质通则》中提及了肽类药物杂质控制的一般要求。 美国FDA于1994年颁布了合成肽原料药药品信息提交的相关要求，但该文件目前无效。 然而，美国FDA近期就肽化学仿制药研究公布了多种复杂肽仿制药的个体用药指南，并于2021年颁布了《仿制药重组DNA衍生药物高纯度合成肽药物指导原则》[4] ]，解释说国际监管机构也开始逐步致力于完善多肽仿制药监管体系的建设。

2 多肽化学仿制药质量研究的特殊技术要求

肽类化学仿制药的药学研究首先应遵循国家总局已发布的化学仿制药一致性评价相关技术指导原则的总体要求，这里不再赘述。 但由于多肽主要由氨基酸组成，化学合成的多肽也引入了许多非天然氨基酸，这使得该类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面都存在与一般化学小分子药物不同的问题。

首先，多肽是由氨基酸组成的链状、支链或环状结构。 因此，除了元素分析、光谱学、质谱等常规方法外，在确认结构时，还需要根据结构特征采用一些不同于小分子化学物质的分析方法，包括但不限于：利用氨基酸组成和手性分析、序列分析或肽图谱等方法确定一级结构，利用圆二色色散、荧光光谱、光散射、X射线衍射等方法确定高级结构等，除仿制药的一级结构氨基酸序列与参比制剂相同外，高级结构也需要与后者一致。 另外，需要关注一些肽类药物超分子聚集成寡聚物或多聚物的现象。 这一性质与多肽药物的活性和体内药代动力学行为密切相关。 如何区分仿制药和参比药的特点？ 制剂的聚集特性和聚集动力学很难匹配。 现有的研究方法包括尺寸排阻色谱、光散射、荧光分析、分析超速离心、凝胶电泳、场流分离和核磁共振。 同时，还应注意仿制药与参比制剂在一些特殊理化性质（如分子量分布、表面电荷分布、粘度、光密度等）上的一致性。

在保证仿制药结构或物质基础与参比制剂相当的前提下，两者的降解杂质谱不应有较大差异。 但由于仿制药的制备工艺往往与参比制剂不完全等同，工艺杂质可能存在明显差异，尤其是一些结构相似的肽类杂质。 对这些杂质的定性和定量研究已成为合理控制多肽化学仿制药质量的关键。 同时考虑到肽类杂质可能具有一般小分子化学药物所没有的特性。 毒性和免疫原性异常，因此杂质限量的测定应有充分的依据。 此外，聚合物杂质是肽类药物中常见的杂质，可能在加工和储存过程中产生。 考虑到该杂质更容易引起特殊的安全问题，对仿制药和参比制剂中的聚合物杂质进行了对比研究。 应该认真对待。

3 多肽化学仿制药质量研究案例

3.1 硫酸鱼精蛋白注射液

该品种20世纪80年代前在美国上市，用于治疗肝素注射过量引起的出血。 目前国内上市的仿制药有3个，但均较早获批，尚未进行一致性评价。 其原料药是从鲑鱼中提取的碱性蛋白质的硫酸盐。 它是一种肽混合物，其中4种主要肽（见表2）的总含量超过90%，其余由次要肽组成。 由于其含有多串精氨酸，且四种主要肽的氨基酸序列非常相似，分离、纯化和质量分析都很困难。 考虑到鱼类来源和提取工艺的差异可能导致仿制药和参比制剂的肽成分存在差异，应采用适当的方法对产品成分进行全面定性和定量分析，并与参比制剂进行比较，以确保仿制药的质量符合要求。

原研公司报道[4]，采用pH=2的磷酸盐缓冲液和低含量乙腈作为洗脱液，对原料药各成分进行液相分离，然后进行序列分析，可以得到该产品中的4种成分。被确定。 主要肽的氨基酸组成和比例，推测二级结构中脯氨酸周围残基的差异导致结构相似组分之间的色谱行为不同，也表明该方法也有望得到应用。用于本产品的大规模生产。 除了色谱方法之外，美国FDA认为仿制药的研究还需要更多的考虑。 他们对来自 5 个不同制造商的硫酸鱼精蛋白进行了研究 [6]。 初步结果表明，不同厂家的原料在热力学性质（如失水量、玻璃化转变温度、熔点等）上表现出一定的差异，但在光谱性质（如红外、圆二色性、一维核磁等），均表明API在溶液中表现出随机卷曲的构象形式和少量的β-折叠，并且是基于QbD原理建立的。 该色谱方法还可以有效表征不同厂家原料药的四种主要肽成分和含量与参比制剂的一致性。 但随后美国FDA研究人员重新审视了研究方法的合理性，进一步认为由于原料缺乏明显的二级结构，红外和圆二色性方法可能对序列的微小变化不太敏感，因此他们使用了核磁共振光谱法和质谱法作为与色谱方法正交的分析手段已被重新评估，以提供进一步的支持[7]。 通过测定1H NMR中Arg、Ala、Gly等关键氨基酸相应特征信号的积分比，并分析质谱中主成分特征峰的质荷比和相对含量，得出结论先前的研究结果再次得到证实。 此外，还可以使用NMR同核或异核二维相关光谱建立用于该产品质量控制的指纹图谱。 上述方法的综合应用对于有效识别不同来源的硫酸鱼精蛋白的定性和定量差异具有一定的参考意义，也可以有效区分正品和假冒伪劣产品（如来自鲱鱼的鱼精蛋白或来自哺乳动物的鱼精蛋白） ）。 蛋白质等）。

3.2 醋酸地加瑞克

该品种分别于2008年和2009年在美国和欧洲上市，2018年获准进口到我国。它是第三代促性腺激素释放激素（GnRH）受体阻滞剂。 对雄激素依赖性肿瘤有治疗作用，适用于需要雄激素去势治疗的前列腺癌患者，目前国内外市场上尚无仿制药。 其原料药是化学合成的线性十肽（图2），含有7种非天然氨基酸。 该原料药易溶于水，但在室温下浓度为0.1～10mg·mL-1的水溶液中会自发聚集，4小时后呈凝胶状。 这个过程受浓度、时间、温度、盐含量、蛋白质等因素影响。 因此，其制剂的冻干粉虽然复溶后1小时内体外稳定性良好，但皮下给药并与体液接触后立即形成凝胶。 它在凝胶中缓慢释放，从而实现长效药物输送[8]。 已发现GnRH类似物在水溶液中均自聚集，并且聚集体的结构和凝胶形成的性质因化合物而异。 由于地加瑞克是两性分子，主要通过亲水端和疏水端相互结合，并延伸、聚集形成纤维网络，最终形成凝胶。 原料的这种条件聚集特性对制剂最终的安全性和有效性影响很大，给药物研究和评价带来困难。

原研公司对地加瑞克的聚集状态进行了结构表征[8]，结果表明其聚合物呈纤维状，纤维直径为5~15 nm，典型的X射线衍射图显示子午线为4.6~ 4.8埃。 定向衍射，表明纵向顺序。 红外光谱显示，形成的淀粉样蛋白聚合纤维无论在体内还是体外都表现出明显的β-折叠结构，但最大吸收峰波数略有不同，表明体内和体外纤维的高阶结构在微观层面上略有不同。 Maji等[9]通过生化染色(如硫黄素T染色、刚果红染色等)和电镜观察进一步证实了地加瑞克的体外聚集特性，并通过透析实验定量证明了该产品的药物释放模式。 （即，药物单体从形成的淀粉样原纤维的末端逐渐释放）。 原产品欧盟审查报告[10]和原公司公开专利[11]均表明，基于原料的聚集特性，结合统计分析，体外加速释放试验之间存在相关性。光密度和粘度的制备和测量值。 因此，原研公司只需控制成品的一些物理和化学性质（如复溶溶液的粘度和光密度）即可确保原研产品在体内的释放行为在批次之间保持一致。 ）在准备标准中。

然而，对于仿制药来说，仅仅证明其与参比制剂一致是不够的。 美国FDA于2021年3月提出了该品种的个体用药指导原则草案[12]，明确该产品的仿制药必须首先满足参比制剂Q1和Q2的要求（即辅料的种类和用量）注射液中含量应与参比制剂一致）。 比制剂），其次要证明原料的一级、二级结构和聚集性质与参比制剂一致，以及制剂必要的理化性质（如复溶时间、乙酸含量、外观、光密度、粘度、pH等）、聚集动力学和体外释放行为进行全面的比较研究。 聚集动力学应在适当的条件下进行，例如缓冲溶液或模拟体内介质。 体外药物释放试验应说明实验设计的合理性，并提供必要的方法学研究和验证信息。 在各种需求中，聚合特性和聚合动态是研究的重点和难点。 除了上述生化方法进行评估外，美国FDA研究人员还建立了基于核磁共振的测试方法[13]。 该方法表明，实时 1H NMR 高场区特征烷基信号在 0 至 2 ppm 之间的展宽可以定性地表明溶液中的聚集结构正在逐渐形成，并且峰面积的变化密切相关地加瑞克早期纳米级的体外聚集速率。 存在定量关系，该方法可以合理解释地加瑞克的一些体外聚集特性（如浓度、pH值、盐和温度对聚集的影响），因此有望用于一致性评价仿制药和参比制剂之间。 性别。 随着技术的进步，我相信更多更好的研究方法将会不断出现。

3.3 醋酸格拉替雷

该品种分别于1996年和2001年在美国和欧洲上市，已有多个仿制药被批准用于治疗多发性硬化症。 但我国无论是原研药还是仿制药均未上市。 原料药为谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、酪氨酸按一定比例(约0.14:0.34:0.43:0.09)组成的肽共聚物混合物。 其结构为：(Glu、Ala、Lys、Tyr)x·，平均分子量为5~9kDa。 文献[14]表明，合成步骤首先活化单个氨基酸并与引发剂结合。 其次，在一定条件下，四个氨基酸以近乎随机的方式聚合形成多肽混合物，然后在一定条件下部分解聚。 考虑到每种氨基酸的反应活性存在差异，因此反应条件的选择对最终产品的物质组成影响较大。 原始原料批次之间也存在一定范围内的差异。 仿制药和参比制剂的质量一致性要求如何比较也是颇具挑战性的。

对于像本产品这样的复杂药物，肽类药物质量研究的通用方法不足以比较仿制药和参比产品的质量。 为此，美国FDA针对个别药品发布了专门指南[15]，明确仿制药在确保仿制药的成分和理化性质与参比制剂一致的基础上，还需要结合制备工艺、起始原料、过程控制和生物活性检测结果。 做出综合评价。 首先，仿制药的制备工艺应与参比制剂一致或相当，特别注重起始原料氨基酸的活化形式以及聚合引发剂和酸裂解反应试剂； 其次，产品的理化性质必须一致，包括4种氨基酸的含量及光学纯度、分子量分布、指纹特征（如红外、圆二色散、核磁共振等）； 第三，聚合和解聚的反应特性应等效，对聚合开始、聚合过程中的链增长、部分解聚和断裂等过程中的物质结构应进行详细研究，并与参比制剂具有可比性； 最后，在典型的体外动物模型中表现出的生物活性应该是等效的。 但值得注意的是，考虑到参比制剂本身的复杂性，《指南》在充分对比研究的基础上，允许仿制药的相关特性在一定范围内变化。

一些文献讨论了如何根据该指南评价仿制药与参比制剂的一致性。 其中，对于物质基础的等效性，美国FDA的研究人员提供了解决方案[16]。 采用核磁共振、不对称场流多角度光散射分离检测和液体质谱等不同分析方法相结合，对3批参比制剂和1批氨基酸比值（酪氨酸和赖氨酸比值）进行对比研究的工具化合物与参比制剂相差 2%）和分子量（远高于参比制剂）。 结果表明，所用方法能够有效检测两种药物分子量、氨基酸比及序列的差异，且具有统计学意义。 这项研究表明，结合使用几种高灵敏度的正交分析方法可能是分析此类极其复杂的 API 的解决方案。

此外，欧盟对该产品的审评思路也可以从Mylan仿制药在欧盟获批上市的审评报告中看出[17]。 仿制药企业首先通过严格控制合成工艺参数、合理制定放行标准来保证仿制药批次间的一致性； 其次，他们使用经过验证的方法来说明仿制药和参比制剂的一级和高级结构的相似性，并证明该方法具有区分成分相似但由不同工艺制备的样品的能力； 再次，分离仿制药和参比制剂中的九种主要成分，通过多种化学和生物手段构建一致性或相似性评价体系。 最后，借助成品及各主要成分的体外、体内生物学研究和临床研究，进一步说明仿制药与参比药的相似性。 体外制药部分整体评价思路与美国FDA基本相同，但欧盟认为此类复杂仿制药的审批可能仍需要临床试验数据的支持。

原研公司采用7种理化方法和7种生物学方法，综合评价仿制药与美国、欧洲上市的参比制剂的相似性[18-19]。 采用低灵敏度理化方法（如分子量分布、考马斯亮蓝染色等）检测结果两者无显着差异，但采用高灵敏度方法（如反相色谱、多相色谱等）检测结果显示两者无显着差异。角光散射、阳离子交换色谱等）检测结果显示，仿制药的成分和比例与参比制剂略有不同。 此外，仿制药的体外细胞测试活性略高于参比制剂，而体内动物研究显示仿制药在给药部位出现局部毒性的频率。 也高于参比制剂。 原研公司的研究结果进一步证实了该类产品的极端复杂性，无论是研发还是监管都需要特别谨慎。

3.4 鲑鱼降钙素

该品种于20世纪80年代之前在美国上市，用于治疗骨质疏松症。 其原料药是一种源自鲑鱼的32肽，其结构中含有一个二硫键（图3）。 目前市售的产品大多来自化学合成或生物重组。 目前我国市场上有多种仿制药，但均上市较早，尚未进行一致性评价。 该品种的结构或理化性质相对不复杂，但由于仿制药的制备工艺与原研药有显着差异，需要更加关注杂质控制的合理性，特别是衍生的独特杂质从准备过程来看。 对于多肽化药中的杂质研究，通常需要同时使用基于不同原理的方法进行交叉研究，重点关注方法对多肽杂质的分离和检测能力。

美国药典（USP）鲑鱼降钙素原料药专着建议采用高效液相色谱法控制合成来源的鲑鱼降钙素原料药中的有关物质，但没有规定具体杂质，仅控制一般单一杂质和总杂质； 制剂 各论中未对相关物质进行管制。 美国FDA根据其审评经验，建立了液体质谱方法来研究已上市的某款鲑鱼降钙素鼻喷雾剂[20]。 经检测，该产品中总杂质含量远高于USP推荐的有关物质方法。 同时，新方法还可以对已知杂质和10种未知杂质进行定性和定量鉴定，表明新方法比药典方法具有更高的杂质分离和检测能力，也证实了采用不同原理的方法进行多肽药物中杂质研究的必要性美国FDA使用该方法对市场上的13种鲑鱼降钙素鼻喷雾剂进行了测试。 结果表明，不同来源制剂质量参差不齐，为进一步加强监管、提高行业整体研究水平提供了依据。 此外，等人。 [21]报道在高温条件下鲑鱼降钙素的降解实验中产生了明显的二聚体或多聚体杂质。 这类聚合物杂质存在于生产过程中，特别是在制备仿制药原料时。 当工艺或制剂中使用的赋形剂与参比制剂显着不同时，可能会发生这种情况。 此类杂质对多肽药物的安全性影响较大，因此需要特别关注。

从上述例子可以看出，对于复杂的肽类药物，特别是涉及多组分、高级结构或聚集性质的肽类药物，在开发仿制药时，应采用不同原理的分析方法，并结合品种特性比较。 应研究参比制剂，全面说明仿制药与参比制剂的一致性。 必要时，应在质量标准中选择适当的指标进行相应的控制。 此外，在仿制药研发初期，应采用适当的方法充分研究工艺过程中可能引入的杂质，包括聚合物杂质，并根据研究结果制定合理的控制策略。 杂质的限制应基于参考准备中的实际杂质水平，并参考相关准则应适当制定，并在必要时注意杂质的特殊安全性。 还应指出的是，由于一些原始肽是在早些时候推出的，因此当时的研究方法是有限的，而且质量的研究和控制标准现在可能还不够。 在开发通用药物时，它也应基于产品的结构特征，结构和功效，安全关系，建立新的质量研究方法并调整控制策略。

4。结论

总而言之，对肽通用药物的研究应符合通用药物研究的一般要求，同时，应考虑其技术特异性。 通用药物的结构和物理和化学特性应等于参考准备，合理控制杂质是成功的关键。 关键是根据物种的特征科学制定研究计划。 目前，市场上有大量的肽药物，但其质量有所不同。 需要紧急改善肽药物的研究，开发和监督水平。 2018年，国务院总办公室发表了“关于改革和改善通用药物的供应保证和使用政策的意见” [22]，提议制定鼓励模仿的药物目录。 目前，已经发布了2批目录[23-24]，共有50个品种。 其中包括多种肽药物，例如和，表明该国对肽仿制药的发展非常重要。 同时，该文件还呼吁改善工业，学术界和医学使用研究的协作创新机制，建立通用药品技术研究联盟，为企业的主要角色以及医院，医院的基本支持作用提供全面发挥。科学研究机构和大学，并加强了通用药物的技术研究。 我们希望通过本文，我们可以与该行业沟通有关肽化学仿制药，促进更多更好的肽仿制药，以更快地推出，并提高药物对中国患者的可及性。