化学合成肽和合成寡核苷酸研发生产指南

一、简介

肽是由多个氨基酸（2≤N≤50）通过酰胺键连接而成的化合物。 其分子大小介于小分子化学药物和大分子生物药物之间。 与小分子化学药物相比，多肽具有更高的药效、选择性和特异性，且代谢毒性更低； 与大分子生物药物相比，多肽的免疫原性较低，可以更深入地渗透到靶点。 组织性好，连续生产成本较低。 基于这些独特的优势，多肽药物近年来越来越受到人们的关注。 据统计，多肽药物市场的增速是其他药物的两倍。 目前，已有数千种多肽药物进入市场用于治疗糖尿病。 、骨质疏松症、癌症、多发性硬化症、慢性疼痛、HIV感染等多种疾病。

在多肽药物兴起的初期，由于多肽药物的特殊性，针对多肽药物的指导原则并不多，对多肽药物的性质认识也不够深入。 随着多肽药物数量的增加和对多肽性质认识的加深，多肽的指导原则也在不断更新和扩展。 美国和欧洲药典中有多个关于合成肽原料质量控制的相关章节，2022年2020年9月，EMA发布了概念文件《关于制定合成肽和合成寡核苷酸研发和生产指南》。 我国SFDA今年还更新了《化学合成肽类药物药学研究技术指导原则》。 这些指南为我们多肽药物的研发提供了重要的参考和指导。

我们知道，活性肽是药物发挥功效的物质基础。 因此，在多肽药物的研发过程中，活性肽（API）的质量控制非常重要，而肽相关杂质的控制是质量控制的一项重要任务。 杂质不仅影响临床试验所用样品的质量和安全性，在药物发现的早期阶段，这些杂质也可能影响药物疗效的判断。 杂质研究不充分甚至可能导致错误的结论。 由于合成肽占国内外批准的治疗性肽药物的大部分（70%以上），今天我们主要讨论合成肽相关的杂质及其可能的生产途径，以期为包装的选择提供一定的信息以及储存条件和制剂处方的制定。 指导。

2. 杂质分类及生产途径

2.1 与合成过程相关的杂质

化学合成技术是肽生产的黄金标准。 该过程最初是在溶液中进行的，后来引入了固相肽合成。 固相肽合成法一经问世就受到了开发者的青睐。 它在过去的几十年里不断发展和成熟，并已牢固地确立了自己的地位。 化学合成第一领导者。 肽的化学合成步骤包括：悬挂树脂-脱保护基团-活化和交联-肽裂解。 在此过程中，去除保护基、活化和交联等步骤容易产生杂质，这通常是需要质量控制的点。

图1 固相合成流程示意图及相关杂质生产途径

顾名思义，缺失肽是缺少一种或多种必需氨基酸的多肽。 氨基酸的瞬时保护基团去除不完全、即将结合的氨基酸活化不充分或交联效率低都会导致缺失肽的产生。 通过质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差（即缺失氨基酸减去水的分子量）来识别缺失的肽。

例如，合成肽药物A的目标分子量为1311.5。 样品中检出分子量为1103.5的杂质，与母肽分子量相差208。 初步推测至少缺失2个氨基酸。 经过计算，当使用脯氨酸（分子量：115）和5-氧代脯氨酸（分子量：129）时，得到的杂质分子量=1311.5-115+18-129+18=1103.5，与检测到的质量一致-杂质的电荷比。

图2 合成肽药物A的质谱图

（图表来自文档2）

图3 合成肽药物A缺失肽的质谱图

（图表来自文档2）

在合成肽的交联过程中，氨基酸通常会过量。 如果过量的氨基酸没有充分洗涤或反应时间太长，氨基酸将再次交联，产生插入肽。 对于插入肽的鉴定方法，质谱中观察到的杂质与目标肽之间的质量差是插入氨基酸的分子量减去水。

例如：上述合成肽药物A的目标分子量为1311.5，样品中检出分子量为1474.9的杂质，与母肽分子量相差163.4。 初步推测插入了酪氨酸，酪氨酸的分子量为181，杂质的分子量=1311.5+181 -18=1474.5，与检测到的杂质质荷比一致。

图4 某合成肽药物A插入肽的质谱图

（图表来自文档2）

当固相反应过程中同时发生氨基酸缺失和氨基酸插入时，就会产生错误打结的肽。

固相合成完成后，永久保护基团的不完全去除将导致保护基团共价连接到肽序列，产生共价连接的肽杂质。 对于此类杂质的鉴定方法，如果质谱中杂质的分子量与目标肽的分子量相差56Da，则所附的保护基团为tBu保护基团。 如果质谱中杂质的分子量与目标肽的分子量相差100Da，则附着的保护基团为tBoc-TCS保护基团。

2.2 与降解相关的杂质

与劣化相关的杂质包括在制造期间通过劣化机制形成的杂质和在储存期间通过劣化机制形成的杂质。 引起多肽不稳定的因素包括氧化、光、高温、pH、离子强度变化、吸附等。肽链中氨基酸的类型和位置对多肽的稳定性有重要影响。 稳定性产生的肽杂质包括：

表肽是指由序列中具有意想不到的手性构型的一个或多个氨基酸残基形成的杂质。 它们可能源自起始材料中的旋光异构体或合成过程中的氨基酸。 由手性中心的烯醇化或氮杂内酯化形成。 表位肽杂质的色谱行为与主成分非常接近，分子量也与主成分相同。 然而分离和识别却比较困难。 氘代试剂可用于水解和衍生化多肽。 水解所得氨基酸的手性异构体含量可用于确定肽链中易发生外消旋化的氨基酸。 通过定向制备可以有效地制备可能的差向异构肽。 有针对性的研究。

图5 表肽形成机制 (A) 烯醇化 (B) 氮杂内酯化

（取自参考文献3）

这里缺失的肽与合成过程中缺失的肽不同。 主要是指断裂肽。 当多肽化合物遇到高温或 pH 变化时，肽键可能断裂，产生断裂的肽。 研究表明，碱性条件最有可能导致肽键断裂。 断裂肽的鉴定相对简单。 杂质和母肽之间的分子量差异可用于推断哪个酰胺键被破坏。

当多肽含有谷氨酰胺或天冬酰胺残基时，可以除去酰胺键以形成谷氨酸或天冬氨酸残基。 有两种形成机制。 一种是直接水解（pH

图6 天冬酰胺脱酰胺杂质产生机理

（取自参考文献3）

天冬氨酸是一种易于异构化的氨基酸。 由于侧链失去水或氨，天冬氨酸很容易环化到主链上，形成琥珀酰亚胺。 琥珀酰亚胺稳定性差，易水解。 开环过程中可形成环、异构体，同时还产生表肽副产物。 其形成机制与天冬酰胺脱酰胺相似。

图7 天冬氨酸相关杂质的产生机理

二叠氮哌酮是指N端活性基团（通常是氨基）攻击β位主链酰胺键的羰基，形成二酮哌嗪类似物，导致缺失两个氨基酸的肽段。 当N端氨基酸空间位阻更大时，每小时反应更容易发生。

图8 二嗪农中杂质的产生机理

（取自参考文献3）

焦谷氨酸是指N末端所含的谷氨酸环化形成吡咯烷酮羧酸。 该杂质可通过质谱鉴定，分子量比母肽（除去NH3）低17 Da。

图9 焦谷氨酸相关杂质的产生机理

（取自参考文献3）

多肽的分子间聚集和自缔合可以导致高分子量杂质的形成，即聚合物。 有两种类型的聚合机制：共价聚合和非共价聚合。 非共价聚合是通过静电或疏水相互作用形成的。 这是一种中间状态。 当溶液浓度、pH值或离子强度发生变化时，这种力很容易减弱或消失。 ，聚合状态恢复到单体状态； 当肽链含有硫醇或酪氨酸时，可通过生成二硫键或形成二酪氨酸而引起共价聚合。 共价聚合是一种稳定的聚合状态，不会随肽浓度、pH、离子强度等变化而改变聚合状态，随着聚合物杂质的分子量和体积进一步增大，很容易增加免疫原性，引起过敏反应。 因此，应合理控制聚合物的含量。 聚合物通常通过尺寸排阻色谱法进行检测，该色谱法可以与质谱法结合以确定聚合物的倍数。

当多肽在储存期间暴露于氧气和光时，会形成氧化杂质。 容易氧化的氨基酸包括含硫氨基酸、组氨酸、酪氨酸和色氨酸。

①含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸）容易发生氧化反应。 有两种氧化途径。 一是生成二硫键，杂质的分子量为母肽分子量的2倍减2。后者生成亚砜、砜和磺酸，杂质的分子量与母肽的分子量母肽通常相差 16Da、32Da 或 48Da（图 10 A、B）。

②酚羟基和酪氨酸的局部位置都可以成为氧化位点。 氧化生成2-氨基-3-(3,4-二恶醇-1,5-二烯基)丙酸，分子量增加14(图10C)。

③氧化组氨酸有两种方法。 一是咪唑环双键氧化成羰基。 氧化杂质与母肽之间的分子量差异为16 Da。 另一种氧化途径是生成正甲酰犬尿氨酸，其分子量相差 48 Da。 (图10D)。

④色氨酸在氧化条件下可生成羟基色氨酸（分子量增加16Da）或犬色氨酸（分子量增加4Da）。 犬色氨酸进一步氧化可生成羟基甲酰犬尿氨酸（分子量增加48 Da）。 ）（图10E）。

图10 多肽氧化降解机理

除了上述降解之外，多肽在还原剂存在下也会发生还原反应，例如二硫键还原为巯基。 该反应与相应的氧化反应形成动态平衡。

此外，物理不稳定性也是需要关注的问题，如对包装材料、滤膜等的吸附，或者当肽的微环境发生变化时，多肽分子的高级结构发生变化等，这些都导致了多肽的稳定性下降。可能会导致药物功效改变或产生安全问题。 风险。

结论：

多肽中的肽相关杂质不仅是药物研发和生产过程中GMP监管需要持续关注的问题。 在药物发现和开发的早期阶段，它们也可能因杂质的拮抗作用或超强的药效而导致开发人员的误判。 因此，通常在进行生物实验时，建议使用不同来源的肽进行复测，以消除杂质对药效的影响。

与合成过程相关的肽杂质包括fmoc脱保护效率低、氨基酸活化或交联效率不足、缺失肽以及因氨基酸过量或反应时间过长而导致的插入肽。 与稳定性相关的杂质包括表肽、裂解肽、脱酰胺杂质、异构化杂质、聚合物、二嗪农和焦谷氨酸、氧化等。通过了解肽类药物中杂质产生的原因，我们不仅可以监控容易产生的合成步骤不仅针对其中的杂质，而且在后续的制剂配方设计和储存过程中，还根据肽的不稳定性导致杂质的产生机制进行针对性的设计。 处方工艺和储存条件确保肽类药物的质量在可接受的范围内。